拉曼光谱在制药领域中的应用：从分子结构到质量控制

引言
拉曼光谱技术作为一种快速、非破坏性的分析方法，正在成为制药领域中最受欢迎的分析测量工具之一，在原料验证、药物生产过程监控以及产品质量控制中都发挥了重要作用。拉曼光谱技术基于拉曼散射原理，通过测量样品与激光光束相互作用后发生的光子能量变化，获取样品的化学成分和结构信息。在实际运用中，激光首先聚焦到样品表面，激发出的非弹性散射信号（即拉曼信号）被收集并导入到光谱仪中，光谱仪对该信号进行波长分离，再由探测器将光子能量转换为电信号以供分析。拉曼光谱技术的一个显著优点是无需提取或制备样品，并且激光可以轻松地聚焦到样品来进行化学测量，这通常可以在一分钟或更短的时间内完成。其快速、高灵敏度和高分辨率的优势使其成为了药物研发和生产中的一项重要工具。本文将深入探讨拉曼光谱在制药领域中的具体应用，包括药物结构表征、药物形态分析、药物质量控制以及药物相互作用研究，并结合真实案例进行详细分析。
 
1. 药物合成研究
一旦确定了潜在的新药，就可以开发、优化该分子的合成方法。拉曼光谱非常适合监测反应物、中间体和产物浓度，确定各种反应类型（例如Diels-Alder反应、Fischer酯化反应、格氏反应和酰基化反应等）的路径、动力学、机制、终点和产率。阿司匹林的合成是一个经典的酰基化反应，反应的历程一般认为有四面体结构的中间体出现，但由于其纯净物难以分离获取，所以一直没有直接的证据证明该中间体的存在。利用拉曼光谱技术在反应过程中进行实时跟踪检测，可以得到在反应过程中不同时刻的拉曼光谱（图1 A），发现了阿司匹林的合成反应过程中有中间体出现，并直接观测到此中间体在波数为1694cm^-1的位置有一明显的拉曼特征峰。光谱经数据处理后，还可以获得到各组分含量的相对变化曲线（图1 B）。
 
图1 （A）实验过程中的拉曼光谱随时间的变化；（B）阿司匹林合成过程中各组分的回归系数及1694cm^-1位置的相对峰高随时间的变化。
 
通过在线拉曼光谱可以清楚、直接地看到反应的进程，轻松确定反应速率、速率常数和产量；在优化反应器温度、催化剂浓度和类型的影响的同时，还可用于确定活化能和反应终点以及优化产率。
2. 药物晶型研究
大多数情况下，原研药企业会使用API最稳定的晶型以避免在生产储存过程中发生晶型转变。为保险起见，仿制药企业通常会选择与参比制剂（RLD）或原研制剂相同的API晶型，以保证相似的稳定性和溶出特性。因此，确定原研制剂中API晶型是仿制药研发的关键步骤，这也是逆向工程中最重要的任务。晶型检测有着一系列可选择的分析方法，如X射线粉末衍射、差示扫描量热、热重分析、红外光谱及拉曼光谱等。然而，对于制剂中无定形或低含量API的晶型检测，可用的方法就相对较为局限。
2.1制剂中无定形API的检测
X射线粉末衍射被认为是多晶型化学物质指纹性和专属性的首选表征手段。一般制剂中的API晶型检测相对直接，但当API为无定形时，X射线粉末衍射检测失去作用，如下所述案例。已知某制剂中API有2种固态形式:无定形和半水合物。为确定2个不同厂家生产的片剂（药片A、B）中API晶型是否一致，首先需要应用X射线粉末衍射对药片A、B中API晶型进行鉴定。对比药片A、B与API的X射线粉末衍射图可见，药片A的X射线粉末衍射图谱与API半水合物特征峰在整个图谱上都有很高的吻合度（见图2a和2d）。因为该API只能以无定形和半水合物形式存在，因此可以基本肯定药片A所含API为半水合物。当比较药片B的X射线粉末衍射图谱（见图2b）与API半水合物时，很难判断药片B中的API是否也为半水合物。由于药片中同时含有晶体辅料（如乳糖）和其他无定形辅料，药片B中API的晶型无法通过X射线粉末衍射来确定。
 
图2 药片A、药片B、无定形API和API半水合物的X射线粉末衍射图
 
应用拉曼光谱技术，比对图3中药片A、B与API的拉曼光谱图。药片A的拉曼图谱与API半水合物的图谱基本一致（见图3a和3d）。同时，药片B的拉曼图谱与无定形API的图谱基本一致（见图3b和3c）。因此，在这种情况下，拉曼光谱可以很好地解决无定形API在制剂中的鉴定问题。通常，不同固态形式API的拉曼光谱间有一定差异。与结晶形API相比，无定形API的拉曼光谱表现为更宽的峰形，且有波数偏移。通过将实测样品的拉曼光谱与不同晶型API的参考拉曼光谱进行比对，可鉴定制剂中API的晶型。
 
图3 药片A、药片B、无定形API和API半水合物的拉曼光谱图
值得一提的是，通常辅料拉曼信号很弱，低于API信号，故拉曼技术用于不同厂家不同辅料的相同制剂时，可以在某些情况下完全排除辅料对API的干扰。该特性极利于制剂中低含量API的晶型检测，即使API的含量较低，其在制剂中的信号仍然有可能被检测到，这对于制剂中API的晶型鉴定尤为重要。
2.2制剂中低含量API的检测
某原研片中API含量较低，仅为0.5%。文献报道API有A、B、E这3种晶型，且晶型E很难制备。比较原研片与文献中3种晶型的X射线粉末衍射图，未找到与3种晶型相对应的衍射峰，再将原研片与片剂中主要辅料一水乳糖的X射线粉末衍射图比较，发现其X射线粉末衍射图与一水乳糖几乎一致（见图4），表明辅料一水乳糖严重干扰了制剂中API的衍射信号。
 
图4 原研片与一水乳糖以及文献中API晶型A、B、E的X射线衍射图
 
应用拉曼技术采集原研制剂的单点拉曼光谱，因单次采集样品信号面积小，可相对有效避开大量辅料的影响，采集到较强的API信号。将已采集到的原研制剂中的拉曼图谱与不同晶型的拉曼图谱相比较，即可鉴定制剂中的API晶型。如图5所示，该原研片采集到的单点拉曼光谱为较纯的API光谱，不受一水乳糖的干扰，且晶型A、B有不同的拉曼特征峰，比对原研片与晶型A、B的拉曼光谱（见图6），可明显看出，原研片中的API为晶型A。
 
图5 原研片和一水乳糖的拉曼光谱
 
图6 原研片与文献中API晶型A和B的拉曼光谱
 
3. 药物质量研究
冻干制剂中药物分布均匀性在一定程度上可反映制剂微观结构的一致性，与冻干工艺密切相关。预冻方式、预冻时间、冻干曲线都可能影响到药物和辅料的析出速度与程度，从而影响冻干物结构和药物分布均匀性。良好的冻干结构能够保证冻干过程中溶剂顺利逸出，反之会增加溶剂挥发阻力。结构上的不均匀可能会导致局部溶剂残留增加，甚至可能会使活性药物成分局部降解，影响产品稳定性和体内药效以及毒性。因此药物分布均匀性是冻干制剂的一个重要质量属性，可在多方面影响产品质量和体内性质，有必要对其进行评价。
近年来，基于不同光谱的显微成像技术在药物质量表征和研究中得到越来越多的应用，通过化学显微成像可以在保持样品完整的前提下直观获得样品内部的结构信息。其中，采用拉曼光谱成像法评价药物活性成分在制剂中的分布均匀性受到了较多关注，主要因为其可以在一定程度上反映产品制剂工艺特征，有助于产品质量评价、工艺分析优化以及伪药劣药鉴别。该评价方法在片剂中的应用已相对成熟，采用夹峰法进行成像处理，便可得到各成分在制剂中的分布成像图。在评价注射用冻干制剂中药物分布均匀性时，夹峰法进行成像处理，结果发现即使将图谱采集精度减小到步长1μm，也无法将制剂中的药物和辅料区分，这是因注射用冻干制剂生产工艺与片剂不同导致的。片剂生产工艺中药物和辅料为物理混合，且粉末粒度通常在微米级别，将图谱采集步长减小到药物辅料粉末粒度以下，采集到的拉曼光谱为单一成分的光谱图，因此采用夹峰法成像可将药物和辅料轻易区分，观察到制剂中药物成分分布的图像。而冻干制剂通常将药物和辅料先全部溶解于同一介质中，经过冷冻干燥过程将液体介质去除形成固体冻干物。此时药物在辅料中呈高度分散的状态，大部分扫描点下的光谱图中都同时含有药物和辅料的特征峰，采用夹峰法成像无法将二者区分。基于内标法拉曼光谱定量分析的原理，可采用药物-辅料峰强度比值法以二者特征峰的相对强度值对冻干制剂拉曼图谱进行成像处理。方法学验证结果表明，该方法可以准确反映冻干制剂中药物与辅料的相对含量，以此对冻干制剂中药物分布均匀性进行分析与评价。同时研究中也发现，由于冻干制剂为疏松多孔的块状物，进行拉曼光谱采集时扫描平面不如片剂平整，导致不同扫描点下的拉曼光谱图信号强弱不一，而采用峰强度比值法进行成像，以药物辅料相对含量进行评价，也可以很好地解决这一缺陷给均匀性分析带来的影响。因此峰强度比值法比经典的夹峰法更适合用于对冻干制剂中药物分布均匀性的评价。
 
图7 五种产品中培美曲塞二钠（峰值1625cm^-1）和甘露醇（峰值480 cm^-1）在5个不同区域的拉曼强度相对比值成像图。标尺100μm。
 
4. 药物制剂的鉴定
拉曼光谱法是重要的分子光谱技术，同红外光谱一样，可用于化合物结构分析，可以对原料药、辅料、药物晶型、药物制剂实现鉴别，其准确度较高。由于水的拉曼散射效应很弱，用拉曼光谱对水溶性注射剂测定时，水不干扰光谱。因此，拉曼光谱在对注射液品种的鉴别上具有红外光谱无法比及的无前处理、简单、准确等优势。
目前已建立了拉曼光谱无损检测液体制剂的快速筛查方法，其原理是通过从注射液的拉曼光谱中将来源于水及其他辅料部分有效排除，对活性药物成分的拉曼光谱与标准参考光谱进行对比判断药物的真伪来实现鉴别。
《中国药典》2010年版附录已经收载拉曼光谱法指导原则，2015年版药典通则收录拉曼光谱法为药典方法，但还没有在品种项下得到体现。在对2010年版药典收录的注射液各论中〔鉴别〕项的调研中，发现有氨茶碱注射液、氨甲环酸注射液等8个品种采用了红外光谱法鉴别。由此可见，采用红外光谱鉴别注射液，主要通过提取、纯化、干燥，在得到纯的药物固体晶体或粉末的基础上实现的。前处理的主要目的是消除水及辅料对红外光谱图的影响。拉曼光谱不用提纯干燥，可以直接测试进行鉴别。因此可以针对上述8个液体品种，探讨使用拉曼光谱替代现有的红外光谱鉴别，或者作为红外光谱鉴别备选项的科学性和有效性。
 
图8 氨茶碱注射液与氨茶碱对照品溶液的拉曼光谱图
 
图9 氨甲环酸注射液与氨甲环酸对照品溶液的拉曼光谱图
 
由图8、图9可知，采用拉曼光谱法进行鉴别，具有前处理简单，鉴别准确度与红外光谱法相当等优势，因此具有使用拉曼光谱替代现有的红外鉴别项，或者作为红外鉴别项的备选项的可能性。通过对152个注射液品种质量标准的调研，发现有23个注射液品种〔鉴别〕项下只有一般化学反应，没有采用仪器的方法；有143个品种的〔鉴别〕项下不包含分子光谱的方法。对于这些品种，拉曼光谱可以作为一个候选的鉴别方法，作为这些注射液品种鉴别的补充，结果将是科学的和有效的。
结论
综上所述，拉曼光谱技术作为一种先进的光谱分析方法，在制药工程中发挥着重要作用。随着技术的不断发展和完善，相信拉曼光谱技术将在制药工程中发挥越来越重要的作用，为药物研发和生产提供更加可靠、高效的分析手段，助力制药行业不断取得新的突破和进步。
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